產(chǎn)品特點(diǎn)
Pfu DNA Ploymerase 是從克隆有 Pyrococcus furiosis DNA Ploymerase 基因的大腸桿菌中表達(dá)并經(jīng)過(guò)柱純化分離出來(lái)的重組蛋白，其分子量為 90kD。該酶具有3’→5’核酸外切酶活性，能糾正 DNA 擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的錯(cuò)配，是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐熱DNAPolymerase中出錯(cuò)率低的。
該酶無(wú) 5’→3’核酸外切酶活性，PCR 反應(yīng)中的延伸速度一般為0.5-1kb/min，比 Taq DNA Ploymerase 要低。該酶熱穩(wěn)定性更好，95℃1 小時(shí)仍保持90%以上的活性，對(duì)于 GC 含量很高的模板，變性溫度可以提高到98℃而不影響其活性。使用該酶進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為平末端，不能直接用 TA 載體克隆。
|
產(chǎn)品組成
|
規(guī)格
|
|
Pfu DNA Polymerase
|
250Ｕ/ 2.5U/μl
|
|
10 × Taq Plus Buffer（含 Mg2+）
|
1m / 2*1 ml
|
|
-20℃，有效期 1 年
|
|
本產(chǎn)品僅供科研使用 ，不得用于其它用途
|
使用方法
（注 意：以下舉例為常規(guī)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的片段大小不同進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整和優(yōu)化）
1. PCR 體系：
推薦體系（50μl）
|
產(chǎn)品組成
|
規(guī)格
|
|
Pfu DNA Polymerase
|
250Ｕ/ 2.5U/μl
|
|
10 × Taq Plus Buffer（含 Mg2+）
|
1m / 2*1 ml
|
|
-20℃，有效期 1 年
|
|
本產(chǎn)品僅供科研使用 ，不得用于其它用途
|
注 意：
A 引物濃度請(qǐng)以終濃度 0.1-1.0μM 作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可 提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
B 鎂離子濃度請(qǐng)以終濃度 1.5-3mM 作為設(shè)定范圍的參考?？筛鶕?jù)不同的引物對(duì)和模板 來(lái)調(diào)節(jié)鎂離子濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系）
2. PCR 程序
|
過(guò)程
|
溫度
|
時(shí)間
|
|
預(yù)變性
|
94℃
|
5min
|
|
25－35cycles
|
變性
|
94℃
|
30sec
|
|
退火
|
55－65℃
|
30sec
|
|
延伸
|
72℃
|
1kb/60sec
|
|
終延伸
|
72℃
|
5min
|
注 意：
Ａ 一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度 Tm 低 5℃，無(wú)法得到理想的擴(kuò)增效率時(shí)，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。
b 延伸時(shí)間應(yīng)根據(jù)所擴(kuò)增片段大小設(shè)定，Taq DNA Polymerase的擴(kuò)增效率為 1 kb/60 sec。
C 可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配機(jī)率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)）
3. 結(jié)果檢測(cè)：
反應(yīng)結(jié)束后取 5 μl 反應(yīng)產(chǎn)物，加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
