產(chǎn)品及特點:
非洲馬瘟病毒(African Horse Sickness Virus,AHSV)會引起非洲馬瘟,是一種馬屬動物的急性或亞急性傳染病,該病以發(fā)熱、皮下結(jié)締組織與肺水腫以及內(nèi)臟出血為特征,只能通過昆蟲傳播。馬對此病的易感性高,病死率高達 95%。本病發(fā)生有明顯的季節(jié)性和地域性,多見于溫?zé)岢睗窦竟?jié),常呈地方流行或暴發(fā)流行,傳播迅速,因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的意義。為此本公司開發(fā)了本產(chǎn)品,可用于在科研領(lǐng)域快速定量檢測非洲馬瘟病毒。
1. 一站式,用戶不需要單獨準(zhǔn)備每種成分,包括引物和對照。
2. 根據(jù)非洲馬瘟病毒的保守基因序列設(shè)計的引物,具有良好的特異性。
3. 靈敏度可以達到 1000 拷貝/反應(yīng)。
4. 使用一管式 RT-PCR 技術(shù),RT 和 PCR 兩步在一個試管內(nèi)完成,不需要中間轉(zhuǎn)移樣品,降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的 RT-PCR。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研,不能用于臨床。
規(guī)格及成分:
編號 |
成分 |
規(guī)格 |
試劑一 |
5×雙酶一管式 RT-PCR Buffer |
200 μL(橘黃蓋) |
試劑二 |
MMLV-Taq Mix |
75 μL(紅蓋) |
試劑三 |
超純水 |
1 mL(亮黃蓋) |
試劑四 |
非洲馬瘟病毒 RT-PCR 引物混合液 |
100 μL(白蓋) |
試劑五 |
非洲馬瘟病毒 RT-PCR 陽性對照(1×10E8/μL) |
50 μL(黃蓋) |
試劑六 |
使用手冊 |
1 份 |
運輸及保存:
低溫運輸,-20℃保存,保存期限為 12 個月。收到貨后陽性對照需要跟其他成分分開放置,因為其容易污染其他成分,造成假陽性。
自備試劑:
樣品 RNA。
非洲馬瘟病毒RT-PCR試劑盒
使用方法:
一、樣品 DNA 的制備:
1. 如果有 N 個樣品,必須設(shè)置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)。可以用10μL非洲馬瘟病毒PCR陽性對照的 1000 倍稀釋液作為制備的陽性對照??梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。制備所得成為樣品 RNA。
2. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。
二、設(shè)置RT- PCR 反應(yīng)(20μL 體系):
3. 如果有 N+2 個樣品,則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管(額外增加的兩個管一個是RT-PCR 陽性對照,另一個是 RT-PCR 陰性對照)并按照下表在 PCR 管中加入下列成分:
成份 |
N+2 個 樣品管 |
RT-PCR 陰性對照 |
RT-PCR 陽性對照 |
5×雙酶一管式RT-PCR Buffer |
各 4 μL |
4 μL |
4 μL |
非洲馬瘟病毒 RT-PCR 引物混合液 |
各 2 μL |
2μL |
2μL |
N+2 個制備的 RNA 樣品 |
各 12.5μL |
-- |
-- |
超純水 |
-- |
12.5μL |
-- |
非洲馬瘟病毒 RT-PCR 陽性對照的 1000倍稀釋液 |
-- |
-- |
12.5μL |
MMLV-Taq Mix |
1.5 μL |
1.5 μL |
1.5 μL |
過程 |
溫度 |
時間 |
逆轉(zhuǎn)錄 |
42℃ |
30 min |
預(yù)變性 |
95℃ |
5 min |
PCR反應(yīng)35個循環(huán) |
95℃ |
30 sec |
58℃ |
30 sec |
|
72℃ |
20 sec |
|
延伸 |
72℃ |
7 min |
5. 瓊脂糖電泳檢測擴增效果。如果陰性對照有擴增產(chǎn)物或陽性對照無擴增產(chǎn)物,則說明實驗失敗,需要分析實驗失敗的原因。只有在陰性對照沒有擴增產(chǎn)物、陽性對照必須有預(yù)期條帶出現(xiàn),才有必要分析樣品的實驗結(jié)果,如果有預(yù)期片段大小的擴增產(chǎn)物則為陽性,如果無則為陰性。