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產(chǎn)品詳情
  • 產(chǎn)品名稱: 一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒

  • 產(chǎn)品型號: 100次×20ul
  • 產(chǎn)品廠商:通蔚生物
  • 產(chǎn)品價格:2070
  • 產(chǎn)品庫存:126
  • 產(chǎn)品文檔:
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簡單介紹:
一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒本試劑盒是專為一步法 RT-PCR 實(shí)驗(yàn)研制,逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行,反應(yīng)過程中無需添加試劑,無需打開管蓋,在避免污染的同時提高了檢測靈敏度和實(shí)驗(yàn)效率。本試劑盒包括全新高效逆轉(zhuǎn)錄酶、快速熱啟動 DNA 聚合酶,同時包含適用于逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)緩沖液和實(shí)驗(yàn)中所必需的其它組分。
詳情介紹:

產(chǎn)品特點(diǎn)
試劑盒是專為一步法 RT-PCR 實(shí)驗(yàn)研制,逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行,反應(yīng)過程中無需添加試劑,無需打開管蓋,在避免污染的同時提高了檢測靈敏度和實(shí)驗(yàn)效率。本試劑盒包括全新高效逆轉(zhuǎn)錄酶、快速熱啟動 DNA 聚合酶,同時包含適用于逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)緩沖液和實(shí)驗(yàn)中所必需的其它組分。

SuperRT 逆轉(zhuǎn)錄酶
RNaseH活性缺失,減少了逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中 RNA 的降解。該逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄效率高,可對少量RNA模板進(jìn)行良好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR 反應(yīng)使用的快速熱啟動 DNA 聚合酶具有擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)、延伸速度快的優(yōu)良性能。獨(dú)特的緩沖體系使逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶同時發(fā)揮大功效。使用本試劑盒擴(kuò)增得到的目的產(chǎn)物 3′端附有一個″A″堿基,可直接用于T/A克隆。

保存條件
長期保存,請置于-20℃,有效期 12 個月。使用后請及時放入-20℃保存以保證酶的活性。

使用方法
1. 將 RNA 模板、引物、2×OneStep RT-PCR Mix 和 RNase-Free Water 溶解 并置于冰上備用。
2. 按下表加入試劑,至終體積 20 μl:

試劑

20μl反應(yīng)體系

終濃度

2×OneStep RT-PCR Mix

10μl

Forward Primer,10 μM

0.5μl

0.25μM

Reverse Primer,10 μM

0.5μl

0.25μM

RNA Template

Xμl

1pg -1μg

RNase-Free Water

up to 20μl


注 意:
引物濃度請以終濃度 0.1-1.0μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下,可提高引物的濃度;發(fā)生非特異性反應(yīng)時,可降低引物濃度,由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
3. 渦旋震蕩混勻,短暫離心,將溶液收集到管底。
4. 設(shè)置反應(yīng)程序,將 PCR 管置于熱循環(huán)儀中,進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)。

反應(yīng)條件:

過程

溫度

時間

反轉(zhuǎn)錄

50℃

5-30min

PCR預(yù)變性

95℃

2min

3040cycles

變性

95℃

30sec

退火

55-65℃

30sec

延伸

72℃

1kb/30sec

終延伸

72℃

5min

注 意:
A. 一般 PCR 實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度 Tm 低 5℃,退火時間一般為20-30 秒,無法得到理想的擴(kuò)增效率時,適當(dāng)降低退火溫度;發(fā)生非特異性反應(yīng)時,提高退火溫度,由此優(yōu)化反應(yīng)條件。
B. 延伸時間根據(jù)擴(kuò)增的片段大小設(shè)定,本產(chǎn)品中包含的 DNA Polymerase擴(kuò)增效率為1 kb/30s。
C. 可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。循環(huán)次數(shù)太少,擴(kuò)增量不足;循環(huán)次數(shù)多,錯配機(jī)率會增加,非特異性背景嚴(yán)重。所以,在保證產(chǎn)物得率的前提下,應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù))
5. 反應(yīng)結(jié)束后取 5 μl 反應(yīng)產(chǎn)物,加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行電泳檢測結(jié)果。

注意事項(xiàng)
1. 在操作過程中應(yīng)避免 RNase 污染,防止 RNA 降解或?qū)嶒?yàn)中的交叉污染,建議在專門的區(qū)域進(jìn)行 RNA 操作,使用專門的儀器和耗材,操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)常更換手套。
2. 實(shí)驗(yàn)盡量使用一次性塑料器皿,若使用玻璃器皿,應(yīng)使用 0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在 37℃處理 12 小時,并在 120℃下高壓滅-菌 30 分鐘后使用,或者將玻璃器皿在180℃下干熱滅-菌 60 分鐘后使用。實(shí)驗(yàn)中用到的無菌水應(yīng)使用0.1%的DEPC處理后進(jìn)行高壓滅-菌。
3.本試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻,盡量避免起泡,并經(jīng)短暫離心后使用。使用后應(yīng)盡快放回-20℃,避免反復(fù)凍融。
4.本試劑盒必須使用特異性引物,引物的選擇可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來選擇,引物設(shè)計的好壞直接影響到 RT-PCR 反應(yīng)的結(jié)果,設(shè)計引物時需考慮 GC 含量,引物長度,引物位置,PCR產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)等因素,建議采用專業(yè)的引物設(shè)計軟件來設(shè)計。
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