產(chǎn)品特點
本試劑盒是基于 T7 RNA 聚合酶的 RNA 體外轉錄試劑盒,它利用含有T7 啟動子的模版 DNA,以 NTP 為底物,從 T7 啟動子下游開始合成與模版DNA 中一條鏈互補的RNA,簡單快速獲得大量的 RNA 分子。
它具有下列特點:
1. 即開即用,用戶只需提供含 T7 啟動子的 DNA 模板即可以進行體外轉錄實驗不需要單獨準備每一個成份。
2. 單溶液預配液,減少加樣次數(shù),避免了操作誤差,增加了可重復性。
3. 模版 DNA 可以是線性化的質粒 DNA,也可以是 PCR 擴增產(chǎn)物。
4. 可以合成的 RNA 的佳長度在 20nt 到 2000nt 之間。
5. 產(chǎn)品配方經(jīng)過精心優(yōu)化,每 1μg DNA 模版可以合成2~6μg RNA。
6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 結構研究、核酶生物化學、體外翻譯、RNA蛋白質相互作用、反義技術、SELEX 技術和 RNA 干擾(RNAi)等實驗。
7. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的體外轉錄實驗并且只能用于科研。。
成分規(guī)格
產(chǎn)品組成
T7 轉錄預配液 2× 0.5 mL
RNase-free 水 水 1mL
保存條件
-20℃可保存 12 個月
自備試劑
Tris 飽和酚、氯仿、RNase-free 75%乙醇。
制備 DNA 模板
(本試劑盒不含所需試劑,此處信息僅供參考)PCR 片段和質粒 DNA 都可以用作體外轉錄的模板,但是必須注意以下幾點。
a)必須使用線性化的 DNA。如果是質粒 DNA,則必須先用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切成線狀。
b) 需要轉錄的 DNA 序列的上游必須有 T7 啟動子。如果模板是PCR產(chǎn)物,則可以在設計引物時將 T7 啟動子序列 5′TAA TAC GAC TC A CTA TAGGG3′加上。如果是將 DNA 片段克隆到載體上,則需要選擇有 T7 啟動子的載體,并且克隆位點必須位于 T7 啟動子下游。
c) 需要轉錄的 DNA 序列的下游端不要是 3′突出。如果是3′突出(比如選擇了 Pst I 來線性化質粒),則用 T4 DNA 聚合酶修平。
d) 必須保證 DNA 模板中沒有 RNase。由于提取質粒 DNA 的過程中一般要使用大量的 RNase A,因此質粒 DNA 一般都有嚴重的 RNase A 污染,所以在用作模板前,采取膠回收的方法純化質粒 DNA。并且加入少量總RNA 一起保溫然后電泳檢測 RNA 是否被降解,以此來判斷純化的 DNA 模板是否有殘留RNase A。如果有 RNase 污染,則必須反復酚氯仿抽提去除殘留的RNase 然后再乙醇沉淀質粒DNA。
體外轉錄反應
1. 如果有 N 個樣品,強烈建議做一個陰性對照,故共設置N+1 個反應,這樣一起并排電泳時容易判斷哪個條帶是模板 DNA,哪個條帶是轉錄擴增得到的RNA。在N+1 個 RNase-free 的塑料離心管中,在室溫下(不是在4℃下)按次序加入下列成分,T7 轉錄預配液容易產(chǎn)生結晶,沉淀一定要握在手中直到結晶徹底溶解并搖勻后方可使用。
成分
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N 個樣品管
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陰性對照管
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DNA 模板
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100-500ng左右的PCR片段或線狀質粒
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-
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2×T7 轉錄預配液
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各10μL
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10μL
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RNase-free 水
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至20μL
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至20μL
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注:此為 20μL 反應體系的用量,對其他反應體系,各成分的用量可以按比例增減。本產(chǎn)品的2×T7轉錄預配液已經(jīng)含有 NTP。如果需要標記 RNA 探針或制備帶帽 RNA,則需要訂購NTP 分開的試劑盒。
2.37℃保溫 1-2 小時(注意:延長保溫時間并不能大幅提高產(chǎn)量。
3. 加入 2μL 自備的 500mM 的 EDTA 溶液滅活 T7 RNA 聚合酶。
4. 取 5μL 電泳,此時加上一個 DNA 模板做電泳對照。電泳時比陰性對照多出的條帶就是轉錄擴增得到的 RNA,由于合成的 RNA 長度不均勻,即使長度均勻,但由于自身形成發(fā)夾結構,泳動速度也不一致,所以電泳所得RNA條帶一般都不是清晰單一條帶,而是比較彌散的電泳條帶。但由于RNA 是單鏈,分子量比同樣長度的 DNA 小一倍,因此 RNA 一般比其雙鏈 DNA 模板電泳速度更快。
5. 定量,可以用自備的單鏈 RNA 定量試劑盒檢測濃度。不推薦使用電泳定量。使用本試劑盒時 1μg 的 DNA 模板一般可以合成 2~6μg 的RNA。
6. 得到的 RNA 可以放 80℃保存。如需去除 DNA 模板,請按下面步驟操作。
去除 DNA 模板(所需試劑需要另購)
1. 在 20μL 體積的體外轉錄體系中加入 2μL 的 10×DNase Buffer 和1μL自備的RNase-free DNase 3~5U/μL。
2. 37℃保溫 30 分鐘。
3. 補 RNase-free 水到 100μL。增加體積可以減少樣品的丟失。
4. 用自備的等體積 100μL 的 Tris 飽和酚和氯仿震蕩混勻后14000g 離心3 分鐘將上清轉移到新的離心管中。此步去除 DNase 和 RNA 聚合酶。
5. 加自備的 200μL 無水乙醇和 10μL 3M 的乙酸鈉溶液(pH5.2),振蕩后14000rpm離心 20 分鐘,RNA 形成沉淀,棄上清。
6. 在沉淀中加入 1mL 75%乙醇,震蕩 10 秒后 14000g 離心5 分鐘,棄上清。
7. 短暫離心數(shù)秒,用槍頭吸棄上清。不要丟失沉淀。
8. 晾干,所得沉淀即體外轉錄所得的 RNA。去除 DNA 模板也可以用 PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒。
問題解答
1. 沒有RNA產(chǎn)物。常見原因是模板有RNase污染,可用純化好的RNA跟模板DNA一起保溫再電泳,再檢測其是否有污染。
2. RNA產(chǎn)量低。常見的原因是DNA模板。在轉錄序列的一個和二個堿基都是G,在前14個堿基內(nèi)避免有U存在。
3. RNA長度比預期的短。可能是模板序列中有T7 RNA聚合酶的終止序列。
4. RNA長度比預計的長。T7 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一樣,有不依賴于模板的加尾功能,有一半的RNA可以帶一個或兩個堿基的尾巴。如果RNA長度比預計的長很多,使用的模板又是質粒DNA,則可能是質粒線性化不徹底。
5. 5′單磷酸還是三磷酸?如果使用GTP,則得到的RNA是三磷酸,體外轉錄時如果保溫時間太長(如12小時),則有50%的三磷酸會變成單磷酸。如果在轉錄體系中加入GMP,則T7 RNA聚合酶將優(yōu)先使用GMP,所得RNA產(chǎn)物中5'端是單磷酸的比例將大大增加。6. 用體外轉錄試劑盒如何得到帶帽RNA?需加入帶帽NTP類似物即可。